登革热IgM捕获法elisa试剂盒

 

登革热IgM检测试剂盒预期用途

DENV Detect IgM-ELISA检测试剂是一种用来定性检测人是否感染登革热病毒的ELISA检测系统，它可以检测出人血清中是否存在抗登革热病毒源性重组抗（DENVRA I-IV）的IgM抗体。此诊断实验可辅助诊断人是否感染了登革热病毒。此试剂盒不能用于筛查血液或血液成分，仅供体外诊断用。

登革热IgM试剂盒检测原理

DENV Detect IgM ELISA试剂盒是由一种酶联扩大的两步法免疫检测系统。在此实验中，将登革热检测阴性质控（代表不反应的血清）、阳性质控和未知抗体浓度的血清样品加入到包被了抗人IgM抗体的微孔中温育，之后分别加入登革热源性重组抗原DENVRA（I-IV）和正常细胞抗原（NCA）进行温育。登革热IgM试剂盒的血清样品必须用样品稀释液进行稀释。温育并洗板后，用HRP标记的DENVRA（I-IV）特异性抗体处理。第二次温育并洗板后，加入TMB底物液进行温育。之后再加入酸性终止液，450nm处测OD值可确定底物反应的程度。当高于一定数值时（临界值），样品的吸光度值可确定样品中是否存在登革热抗体。

注意：阴性质控和弱阳性质控以内在质控形式提供，其目的是为了监测试剂盒成分的完整性。

登革热检测特定材料
1.抗人IgM包被的包被板：带板盖的板架，抗人IgM包被的96孔包被板。2-8℃下储存，有效期内稳定。抗人IgM包被的微孔可捕获人样品中的IgM抗体。
2.样品稀释液：1瓶，25ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，0.05%的Proclin-300防腐剂。用于试验样本，阴性质控和阳性指控的稀释，2-8℃下储存，有效期内稳定。
3.即用型的登革热重组抗原：1瓶，3ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，0.05%的Proclin-300防腐剂，2-8℃下储存，有效期内稳定。
4.即用型正常细胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐温20的Tris-HCl缓冲液，0.05%的Proclin-300防腐剂，COS-1细胞上清。，2-8℃下储存，有效期内稳定。
5.登革热检测阴性质控：1支，50ul的阴性血清，登革热检测阴性质控可辅助监测试剂盒的完整性。2-8℃下储存，有效期内稳定
6.登革热检测阳性质控：1支，50ul的阳性血清，登革热检测弱阳性质控可辅助监测试剂盒的完整性。2-8℃下储存，有效期内稳定
7.10倍浓缩洗涤液：1瓶，120ml，含吐温20的磷酸缓冲盐，2-8℃下储存，有效期内稳定。
8.HRP标记的即用型酶联物，1瓶，6ml，HRP标记的黄热病毒活性单克隆抗体，含吐温20的Tris-citrate缓冲液，＜0.01%的硫柳汞防腐剂和添加剂，2-8℃下储存，有效期内稳定。
9.Enwash：1瓶，20mlEnwash溶液，含吐温20的磷酸缓冲盐，2-8℃下储存，有效期内稳定。
10.TMB底物液：1瓶，9ml，2-8℃下储存，有效期内稳定。注意：底物液必须始终储存于避光试剂瓶中。
11.终止液：1瓶，内含6ml即用型的终止液，2-8℃下储存，有效期内稳定。
注意：强酸，请戴保护手套、口罩和安全镜，按照安全条理处理所有的材料。


登革热IgM检测实验所需器材但试剂盒不提供
■可在450nm处读数的酶标仪
■生物学或高纯度水
■真空泵
■洗板机
■1-10ul的单道移液器，50-200ul的单道和多道移液器。
■聚丙烯试管
■Parafilm封口膜
■计时器
■旋涡混合器

登革热IgM检测试剂盒检测步骤
1.阳性质控、阴性质控必须做双孔检测，未知样本血清可做单孔或双孔检测（DENV和NCA都得做）。按照说明书上的操作流程图进行操作。如果做双份检测的话，96孔板可做22个样品。
2.将实验中使用的板条标记好。
3.用试剂盒提供的样品稀释液将血清和质控品稀释100倍。用小聚丙烯试管进行稀释，稀释时至少需要4ul血清、阳性质控和阴性质控。如：4ul血清加396ul稀释液。
4.用单道或多道移液器将稀释好的血清、阴性质控和阳性质控各50ul加入到相应的微孔中。如下为22个样品做双份检测时的示范图。注意，所有的样品都必须用DENVRA和NCA检测。
5.用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。
注意：这样是为了保证温度的分布在每个孔的底部和血缘相等地散播。一旦顶部密封阻碍了蒸发，任何多余的封板胶必需被剪掉。
6.37℃下保湿温育板条1小时，注意：不要将微孔板叠放，必须单独地分层平辅。这对于温度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何气体，不要让板条接触任何湿润的物质，如湿纸巾等。
7.温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。
8.在A-D条中加入50ul DENVRA（I-IV），在E-H条中加入50ul NCA。
9.用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）
10.37℃下保湿温育板条1小时。（同步骤6）
11.温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。
12.用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP标记的酶联物。
13.用封板胶仅在开放的微孔表面封板，所有板条的底部是没有覆盖的。（同步骤5）
14.37℃下保湿温育板条1小时。（同步骤6）
15.温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。
16.用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17.室温下温育（无需盖板）5min。
18.温育后，用洗板机洗板6次，每次每孔300ul。
19.用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20.室温避光温育10min。
21.温育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul终止液，室温温育1min。
22.温育后，450nm处测  OD值。

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