大鼠TNF αELISA检测试剂盒
日本IBL进口原装 货号:27194 规格:96T
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前言简介肿瘤坏死因子α是分子量为17.5 kDa,由157个氨基酸组成的强效淋巴因子,在各种肿瘤细胞和靶细胞发挥着细胞毒素作用. 肿瘤坏死因子α在炎性前症发挥关键作用,并能在患有风湿性关节炎病人的骨滑液中检测到.它是免疫调节作用的初始调节者. 肿瘤坏死因子α的分泌是经过严格控制的,由极小量的休眠细胞分泌,主要为激活细胞的分泌因子.
原理此试剂盒运用了两种特异性抗体,洗板后加入TMB底物液显色,显色的强度与大鼠肿瘤坏死因子α的量成正比.
检测范围56.25 ~3,600 pg/mL
预期用途 ■此IBL试剂盒能用于大鼠细胞培养上清中肿瘤坏死因子α的定量检测
■重组和天然的大鼠肿瘤坏死因子α都能检测
试剂盒成分1 预包被板: 抗大鼠肿瘤坏死因子α兔子IgG,亲合纯化 96T
2 酶标记抗体:
(30倍浓缩)HRP标记抗大鼠肿瘤坏死因子α兔子IgG,亲合纯化 0.4mL x 1
3 标准品: 重组大鼠肿瘤坏死因子α 1.0mL x 2
4 EIA缓冲液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 30mL x 1
5 标记抗体稀释液: 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 12mL x 1
6 显色剂: TMB底物液 15mL x 1
7 终止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 浓缩洗涤液:
(40倍浓缩) 含1% BSA, 0.05%吐温20 BPS 50mL x 1
操作说明1实验所需器材(但试剂盒没有提供) 酶标仪(450nm) 微移液管及其枪头
量筒及烧杯 去离子水
冰箱(4°C) 坐标纸(log/log)
吸水纸 试管(用于标准品稀释)
温育箱(37°C ± 1°C)
洗瓶(用于洗板)
一次性试剂管(用于浓缩酶标记抗体和显色剂)
2准备 - 洗涤液的准备
试剂盒的洗涤液是一种40倍浓缩液,用1950 mL去离子水稀释50 mL的浓缩洗涤液,制成2000mL即用稀释洗涤液. 置于冰箱内可保存2周.
- 酶标记抗体的准备
试剂盒中的标记抗体是一种30倍浓缩物,根据所需量,用标记抗体稀释液稀释30倍.
示例:
如果你用一条板(8孔),就需800 μL.的标记抗体.就用870 μL的标记抗体稀释液稀释30 μL抗体浓缩液,充分混匀.并每孔各加100 μL
浓缩酶标记抗体需稀释后才能用于实验剩余的稀释标记抗体液需密封瓶装,存于4°C
- 标准品的准备
加
1.0mL的去离子水到瓶装标准品,制成浓度为7,200 pg/mL大鼠肿瘤坏死因子α标准品液
- 标准品的稀释
准备8支试管,
并每支各加230 μL EIA缓冲液.稀释成如下浓度,步骤如下图所示:
试管1 3600 pg/mL
试管2 1800 pg/mL
试管3 900 pg/ mL
试管4 450 pg/mL
试管5 225 pg/mL
试管6 112.5 pg/mL
试管7 56.25pg/mL
试管8 0 pg/mL(样品空白对照)
吸取230ul的标准品液于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀,如下图所示,按此规律稀释,系列标准品的浓度范围为56.25-3600pg/mL,第8号管为0 pg/mL作为样品空白对照
- 样品稀释
样品如需稀释时,必须用EIA缓冲液进行稀释
如果样品中大鼠肿瘤坏死因子α的浓度范围一无所知的话,预先准备几个不同稀释梯度的样品液来确定*的检测浓度.
3实验步骤使用前,将所有试剂应平衡至室温,大约30min,充分混匀,确保试剂质量无改变,标准曲线和样品检测必须同时进行.
试剂 | 待检测样品 | 标准品 | 样品空白 | 试剂空白 |
检测样品100ul | 稀释标准品(1-7管)100ul | EIA缓冲液(第8管)100ul | EIA缓冲液100ul |
盖板,于4°C下温育过夜 |
洗板7次 |
酶标抗体 | 100ul | 100ul | 100ul | - |
盖板,于4°C下温育30min |
洗板9次 |
显色剂 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
室温避光温育30min |
终止液 | 100ul | 100ul | 100ul | 100ul |
加终止液后,30min内于450nm处读取OD值 |
1)设试剂空白对照,并于相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液
2) 确定好样品空白对照孔,检测样品孔和标准品孔,分别将100ul样品对照品(8号管)、检测样品和稀释好的标准品(1-7号管)加入到相应的微孔中。
3)盖板,4°C下温育过夜
4)用洗涤瓶剧烈洗板,再加入稀释洗涤液,静置15-30秒,再*倒去孔内反应液
重复洗板7次.
zui后在吸水纸上拍干,去除残留液滴
如用自动洗板机洗板,先自动洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次5)除试剂空白对照孔外,其余每孔各加100ul酶标抗体
6)盖板,4°C下温育30min
7)按照上述步骤4)洗板9次
8) 用一次性试管取所需量的显色剂,各加100ul显色剂于微孔中.为了避免污染,勿将剩余试剂在倒回试剂瓶中
9)室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
10)每孔各加100ul终止液,溶液颜色会变成黄色
11)擦去微孔板底部的污迹或水滴,确保微孔内溶液无气泡产生.加入终止液后30min内于酶标仪450nm处读取结果
特别注意 - 收集样品后应尽快检测. 如需保存, 冻存样品,但要避免反复冻融.检测前,将样品解冻至室温.
- 如样品需稀释,用EIA缓冲液稀释
- 样品和标准品建议做双份检测
- 保持样品处于中性PH范围.有机溶剂的污染会影响实验结果
- 只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板.不充足的洗板会导致错误的结果
- 在吸水纸上拍干去除残留液滴时,切勿用吸水纸刮擦孔内壁
- 显示剂应避光保存并避免与金属物质接触
- 加终止液后,30 min内就应读取实验结果
结果计算所有实验数据(包括标准品,检测样品的OD值),都应减去样品空白对照的OD值.
在log-log坐标纸用,以较正的OD值为纵坐标,相对应的浓度为横坐标,建立标准曲线. 样品直接在标准曲线上获取浓度值.
标准曲线示范
上图所示典型标准曲线仅用于演示示范,不能用于试验数据的获取.每次实验都应建立其标准曲线.
常规事项1所有试剂置于2 - 8°C保存.实验前将试剂平衡至室温(约30分钟)
2瓶装标准品是冻干品,故小心打开瓶盖
3终止液是强酸物质.使用时,避免其接触皮肤和衣肤.
4弃置用过的物质前,用水冲洗
5 浓缩酶标抗体,EIA缓冲液和浓缩洗涤液可能会出现沉淀,但这并不会影响实验
6使用试剂后应洗手
7切勿混用不同批号的试剂
8别使用过期的试剂
9试剂盒仅供研究用,不能用于临床诊断.
存储与有效期存储条件:2 - 8°C
有效期见试剂盒外包装
本译文仅供参考,详情请以原文为准 中国*总代理:深圳市AG九游国际生物工程有限公司公司地址:深圳市南山区蛇口沿山路10号6层。
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