人α–klotho ELISA Kit

（人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒）

日本IBL*，货号：27998
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人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
前言简介
α–klotho是经基因改造（类似患有人衰老症状）小鼠体内的一种负调节基因，其基因序列存在多个种属，包括基于小鼠研究的人类，α–klotho蛋白是一种分子量约为130kDa的横跨膜蛋白，在肾脏和甲状旁腺内表达.
近年来，已证实α–klotho是机体调节矿物质代谢的重要因子，如钙和磷的代谢.因此认为,小鼠幼龄老化症状就是因为α–klotho的缺失导致矿物质稳态破坏而引起的. 同时，据报道,构成α–klotho蛋白序列主要部分的长N-端胞外域可经分离释放至血液.然而对于可溶性α–klotho蛋白发挥的功能和变化仍存很多疑点，所以急需研制一套α–klotho检测系统
此ELISA试剂盒可用于检测人血液的α–klotho蛋白
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
实验原理
此固相ELISA试剂盒基于夹心法原理，利用两种不同的高特异性抗体，TMB作为底物显示剂，显色强度与人可溶性α–klotho的量成正比
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
检测范围
93.75~6000pg/mL
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
预期用途
此试剂盒可用于血清，血浆和尿液中人可溶性α–klotho的定量检测
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
试剂盒组成
 

1. 包被板: 包被有抗人可溶性α–klotho（67G3）小鼠IgG单抗，亲和纯化      96T x 1
2. 浓缩标记抗体

: （30X） HRP标记的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’亲和纯化              0.4ml x1
 

1. 标准品: 重组人可溶性α–klotho                                         0.5mlx2
2. EIA缓冲液:                                                           30mlx1
3. 标记抗体稀释液: 1%BSA，含0.05%吐温20的PBS                          12mlx1
4. 显色剂:TMB底物液                                                    15mlx1
5. 终止液: 1N硫酸                                                       12mlx1
6. 浓缩洗涤缓冲液: （40X）含0.05%吐温20的磷酸缓冲液                       50mlx1

人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
实验所需材料（ 但试剂盒未提供）
酶标仪（450nm）      微量移液管和加样枪头
量筒和烧杯            去离子水
吸水纸                坐标纸
标准品稀释管           洗瓶
一次性试管
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
试剂准备
 

1. 洗涤缓冲液的准备：

先将（40X）洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得. 稀释洗涤液应保存于冰箱内，2周内用完
 

1. 酶标记抗体的准备：

用标记抗体稀释液将标记抗体稀释至30倍，即得
例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔各加100ul）
此步骤应在标记抗体使用前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，于4℃保存
 

1. 标准品的准备：

吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho标准品
 

1. 标准品的稀释：

准备8个试管用于标准品的稀释，各加230ul的EIA缓冲液, 配制成以下8管浓度
1号管                 6000pg/ml
2号管                 3000pg/ml
3号管                 1500pg/ml
4号管                 750pg/ml
5号管                 375pg/ml
6号管                 187.5pg/ml
7号管                 93.75pg/ml
8号管                 0pg/ml（试验样品空白）
吸取230ul的标准品于1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀，如下图所示,按此规律稀释，标准品范围为6000~93.75pg/ml. 8号管作为样品空白,浓度为0pg/ml.

 

1. 样品稀释：

根据要求,用EIA缓冲液稀释样品.血清,血浆或尿液样品建议稀释2~4倍
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实验步骤
使用前，将所有试剂应平衡至室温，大约30min，充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行.
 

• 设试剂空白对照，并于相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液
• 确定好样品空白对照孔，检测样品孔和标准品孔，分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
• 盖板，室温下温育60min
• 用洗涤瓶洗板，在微孔中加入洗涤液浸泡15-30秒，弃去洗涤液。重复7次，zui后在吸水纸上拍干.

如用洗板机洗板4次，需再用洗瓶洗板3次
 

• 除试剂空白对照孔外,每孔各加100ul酶标抗体
• 盖板，室温下温育30min
• 按照上述步骤4）洗板9次
• 用一次性试管取所需量的显色剂，各加100ul显色剂于微孔中.为了避免污染，勿将剩余试剂在倒回试剂瓶中
• 室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
• 每孔各加100ul终止液，溶液颜色会变成黄色
• 擦去微孔板底部的污迹或水滴，确保微孔内溶液无气泡.加入终止液后30min内于酶标仪   450nm处读数

特别注意
 

1. 试验样品采集后应立即检测或冻存,避免反复冻融样品,检测前应在低温下先将其*溶解混匀

尤其是尿液样品，温度和冻融对其比血浆或血清稳定性影响更大,所以样品采集后应立即冻存，避免重覆冻存
 

1. 试验样品根据所需,用EIA缓冲液稀释
2. 建议各试验样品和标准品做双份检测
3. 试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响实验结果
4. 只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板，不充足的洗涤会导致试验失败
5. 用吸水纸拍干微孔板，避免刮擦
6. TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属
7. 加入终止液后,30min内必须读数

 
 
 
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结果计算
绘制标准曲线前，所有的数据（包括标准品和未知的样品）都应减去试验样品空白值.以标准品的浓度及相对应OD值，在坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
 

此标准曲线仅供示例演示,不能用于获取试验数据.每次检测都应建立其标准曲线.
 
 
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒
 
 
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
 
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