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内皮素-1（一种21个氨基酸分子组成的多肽）是目前所知的zui有效的血管收缩剂。1985年Rubanyi研究小组发现了一种多肽并将其命名为内皮源性收缩因子（EDCF），之后Yanagisawa将其分离、测序、克隆，并命名为内皮素，而且认为它是zui有效的血管收缩剂，这使得人们了解到它更多的生理功能。内皮素-1（ET-1）是哺乳动物三种血管活性肽家族中的一种，这三种血管活性肽还包括内皮素-2和内皮素-3。这两种相关多肽的2和6号位的氨基酸与ET-1的不同。这些基因可以产生三种前肽，之后可分解成三个含39个氨基酸分子的内皮素分子。我们可以获得一系列内皮素多肽和前肽家族的功能概述和分子生物学知识。ET-1对平滑肌细胞、成纤维细胞有强烈效应，并且它也参与很多疾病过程，特别是心血管疾病。ET-1在充血性心力衰竭、肾衰竭和肺动脉高血压中有重要作用。人的ET-1和牛、犬、鼠、猪、兔和大鼠的ET-1有相同的氨基酸序列。

此试剂盒是一种夹心法的ELISA试剂盒，整个试剂盒使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂，zui终溶液所显示的颜色强度与样品中ET-1的量成正比。测量范围：0.78～100pg/ml

IBL的ET-1 ELISA试剂盒可用于人血清、EDTA血浆、细胞培养液上清和组织提取液中ET-1的定量检测。

1）  包被板：微孔用抗ET^15-21兔IgG包被，96孔。

2）  浓缩型酶标抗体：HRP标记的抗ET-1兔IgG Fab片段，30倍浓缩，0.4ml。

3）  标准品：ET-1，0.5ml×2。

4）  EIA缓冲液：内含1%的BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液，30ml。

5）  用于稀释酶标抗体的稀释液：内含的1%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液，12ml。

6）  显色剂：TMB底物液，15ml。

7）  终止液：1N的H2SO4，12ml。

8）  浓缩洗涤液：内含0.05%吐温的磷酸缓冲液（40倍浓缩），50ml。

1）  酶标仪（450nm）

2）  微量移液器和取样吸头

3）  带刻度的量筒与烧杯

4）  蒸馏水

5）  温育器（37℃±1℃）

6）  冷床箱（4℃）

7）  坐标纸（log/log）

8）  吸水纸

9）  用于稀释标准品的试管

10）              洗涤瓶

11）              酶标抗体稀释的一次性试管

12）              提取用的Sep-Pak C-18柱和试剂，见“样品处理应注意的问题”

1）  洗涤液的准备：洗涤液是一种40倍浓缩的缓冲液，使用前应当将洗涤液平衡至室温，并混合均匀。用1950ml蒸馏水稀释50ml浓缩洗涤液，混合均匀，这就是即用型的洗涤液。稀释后的洗涤液应当储存于冰箱中至2周

2）  酶标抗体的准备：标记抗体是30倍浓缩的，根据实验所需要的量，用酶标抗体稀释液将浓缩酶标抗体稀释30倍，稀释后就可以用了。例如：如果您检测8孔，则需要800ul即用型的酶标抗体（用870ul酶标抗体稀释液稀释30ul浓缩的酶标抗体，并混合均匀，使用时每孔加100ul）。酶标抗体应当在使用前临时将其准备好。剩余的浓缩酶标抗体应当密封储存于4℃的环境下。

3）  标准品的准备：在试管内，用0.5ml蒸馏水稀释标准品，并混合均匀，稀释后ET-1标准品的浓度为200pg/ml。

4）  标准品的稀释：为标准品稀释准备9个试管，在每个试管中加入230ul EIA缓冲液。每支试管的具体浓度如下：

将230ul标准品溶液加入到试管1中，混合均匀；之后将230ul试管1中的溶液加入到试管2中，将标准品连续两倍稀释来确定8点标准品（浓度为100pg/ml到0.78pg/ml），EIA缓冲是检测样品空白对照，浓度为0pg/ml。

如图：

 

5）  检测样品的稀释：如果有必要稀释的话，用EIA缓冲液稀释检测样品。如果您要用血清、血浆或组织样做样品，有必要用Sep-Pak C-18提取柱进行预提取。（见 “样品处理应注意的问题”）

在实验开始大约30分钟时，将所有的试剂都平衡至室温。轻轻的并充分混匀试剂。确保所有试剂都未变质。标准曲线的准备应当与样品的检测同时进行。

1）  确定好空白孔，并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。

2）  确定好样品对照孔，检测样品孔和标准品孔，然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。

3）  盖板，4℃下温育一整夜

4）  用洗涤瓶洗板，在微孔中加入洗涤液再浸泡15-30秒，弃取洗涤液。重复7次，zui后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时，用洗板机洗四次后，再用洗涤瓶洗3次。

5）  每一微孔中加入100ul酶标抗体。

6）  盖板，37℃下温育30min

7）  按照步骤4）洗板9次

8）  将所需量的显色剂加入到试管中，然后每孔内加入100ul显色剂。为了避免污染，请勿将剩余试剂在倒入显色剂原装瓶中。

9）  室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色

10）              在每一微孔中加入100ul终止液，此时溶液颜色会变成黄色。

11）              移去包被孔底的杂质或水滴，同时确保液体表面无泡沫， 30min内在450处读取OD值。

1.     样品采集后应立即检测，如需贮存的，则应放置在冰冻条件下，避免反复冻融，检测前应在低温下将其溶解并*混合

2.     如有需要，样品可用EIA缓冲液稀释

3.     建议试验样品和标准品做双份检测

4.     试验样品应在中性PH范围内，有机溶剂的污染会影响试验

5.     只能使用试剂盒内提供的洗涤液洗板，洗板不充足可能会导致试验失败

6.     *倒去洗涤液，吸水纸上拍干，不能用吸水纸擦拭微孔

7.     底物液应避光保存，因其对光敏感，且要避免接触金属

8.     加入终止液后30min内读数

绘制标准曲线前，将所有的检测孔（包括标准品和未知样品）的OD值都减去检测样品空白孔的OD值。在对数坐标纸上，以标准品的OD值（减去空白后的值）对其相应的浓度，通过这些点作一条平滑的标准曲线。我们可以从标准曲线上读取未知样品的浓度值。

典型标准曲线

 

 

附：采用全自动酶标仪检测，只需检测前设置好酶标仪的相关参数，如坐标参数（线性，半对数）和计算方式参数（三次回归、四参数或双对数曲线方程），即可直接得到结果

 

直接用于检测的样品所含蛋白浓度低（如细胞培养液上清，尿液等），但是，抽提物中要求高浓度蛋白（如血浆，血清，组织匀浆等），样品抽提建议采用Sep-Pak C-18柱：

1. Sep-Pak C-18柱预处理^（1）

a. 4ml纯乙醇冲洗

b. 2ml的去离子水冲洗2次

c. 2ml 0.1%的TFA液冲洗2次

2.样品预处理

a. 血浆（血清）-6ml 10%乙酸与2ml血浆混合

b. 组织样品

（1）组织样品和匀浆内加入1M的乙酸和20mM盐酸溶液

（2）煮沸10min后，10000rpm下离心10min，收集上清

3. 样品抽提

a. 样品加入至Sep-Pak C-18柱

b. 3ml去离子水洗柱3次

c. 用合适的溶液^（2）洗柱收集2ml样品至瓶内

4. 检测

采集的样品应冻干和冻存，贮存的样品用0.1ml的溶液^（3）和0.2ml的EIA缓冲液混合，确保样品PH在中性范围内。样品间的回收率存在不同，请提前做回收试验

（1）       产品型号：WAT023501 ,Waters生产

（2）       去离子水里加入0.1%的三氟乙酸^（4）和60%的乙腈

（3）       0.1%三氟乙酸的DMSO

（4）       货号：206-10731，日本生产

贮存和稳定性

贮存条件：2-8℃

有效期标记在外盒上

 

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

 

 

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