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此ELISA试剂盒可用于人血清中二氢睾酮的定量检测。注：仅供体外诊断用。

此ELISA试剂盒采用的是典型的竞争法。标准品、质控品和病人样品中的未标记抗原和酶标抗原竞争结合包被板上有限的抗体结合位点。洗板以除去未结合的物质。洗板后，加入酶底物液。zui后加入终止液以终止酶反应，并在酶标仪上读取OD值。包被孔中溶液所显示的颜色与样品中DHT的量成正比。实验中所用的标准品可作一条标准曲线，我们可以直接从标准曲线上读取样品和质控品中DHT的量。

5α-二氢睾酮（DHT）是一种类似于睾酮和雄烯二酮的类固醇激素，属于雄性激素类。 DHT是一种含19个碳的类固醇，并具有雄性激素的活性。雄性激素主要由睾丸的莱迪希细胞分泌。循环于血液中的雄性激素会结合到一些蛋白质上，尤其会结合到SHBG（性激素结合蛋白）和清蛋白上。只有极少一部份以未结合的形式存在于血液中，被称为游离部份。DHT对SHBG的亲和力是睾酮对SHBF亲和力的3倍。在男性中，有70％的DHT是由外周睾酮转化而来；而在女性中，大多数DHT是由雄烯二酮转化而来。肝是抑制雄性激素功能的主要器官。因此，类固醇激素在肝中都会发生结构改变，人们普遍认为这各种结构改变是其生物活性丧失的必要条件。在到达肾排泄前，此种类固醇会形成一些代谢产物，而有些类固醇又会回到血液循环中。因此，人体内的类固醇激素是通过尿液排出体外的。临床倾向：在克兰费尔特综合征中，DHT的水平比正常人的要低很多。在先天性多毛症患者中，有40％以上患者的DHT水平都会升高。在多囊卵巢患者中，大约35％患者的DHT水平会升高。成年人的DHT水平比正常老年人的DHT水平要高很多，因此雄性激素在青春期的分泌量会增加，这样它就可以促进男性第二性征的形成。人们已经证实:人睾丸的生精小管可产生DHT。因此，在生精小管受损时，DHT的生成就会受阻，从而导致血浆DHT水平降低（例如：生殖细胞不发育症和精子缺乏症患者）。无睾畸形患者的血浆DHT的水平就非常低。据报道：在一些前列腺癌患者中（特别是第四阶段），DHT的检测有益于预测抗雄性激素治疗的治疗效果。

进行一次双份检测大概需要0.2ml血清。采集4-5ml血液到相应的标记试管中，并待其凝血，离心获取血清。4℃下可稳定存放24个小时，如果实验过几天再做，可将样品冻存-10℃的环境或更低温度下。

此检测系统是一直接检测系统，不需要进行任何样品预处理。

1）移液器，50；100；150和300μl

2）取样吸头

3）蒸馏水或去离子水

4）摇床

5）酶标仪

1）兔抗DHT抗体包被的可拆包被板，即用。内含：抗DHT抗体包被的96孔包被板，密封于含干燥剂的包半装袋中，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期。

2）HRP标记的DHT酶联物，50倍浓缩型，内含：HRP标记的DHT酶联物、蛋白缓冲液和无汞防腐剂，体积：200μl/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期，制备：使用前用检测缓冲液按1：100的比例进行稀释（例如：20μl HRP酶联物中加入2ml检测缓冲液。如果整个包被板都使用，可以用12ml检测缓冲液稀释120μl HRP酶联物，弃去剩余试剂。

3）DHT标准品，即用。6支，内含：DHT、人血清白蛋白和无汞防腐剂，用缓冲液和一定量的DHT制备而成。下表为标准品的大概浓度，具体浓度请见试剂瓶标签：

储存于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上有效期，一旦打开，所有的标准品都必须在14天内用完或将其冻存，避免反复冻融。

4）质控品，即用，1支，内含：DHT、人血清白蛋白和无汞防腐剂，用缓冲液和一定量的DHT制备而成，具体浓度及可接受范围请见试剂瓶标签。体积：0.6ml/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期，一旦打开，所有的质控品都必须在14天内用完，必免反复冻融。

5）浓缩冼涤液，10倍浓缩型，1支，内含：缓冲液、非离子型去垢剂和无汞防腐剂，体积：50ml/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，有效期：12个月或标签上的有效期，制备：使用前用蒸馏水或去离子水按1：10的比例进行稀释，如果整个包被板都使用，可用450ml蒸馏水稀释50ml浓缩冼涤液。

6）检测缓冲液，即用，1支，内含：蛋白缓冲液和无汞防腐剂，体积：15ml/支，稳定性：12个月或标签上的有效期。

7） TMB底物液，即用，1支，内含：TMB、过氧化氢和非DMF或DMSO，体积：16ml/支，储存：冷藏于2-8℃的环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期。

8） 终止液，即用，1支，内含：1M的硫酸，体积：6ml/支，储存：冷藏于2-8℃环境下，稳定性：12个月或标签上的有效期。

样品预处理：无

使用前必须将所有的试剂都平衡到室温，标准品、质控品和样品都必须作双份检测，一旦实验开，所有的步骤都必须完整的进行下去。

1）制备好即用型的HRP酶联物和检测缓冲液。如果用尿液作实验，应将尿液稀释好。

2）取出所需数目的板条，将不用的板条重新密封于包装袋中并冷藏。

3）将标准品、质控品和样品（血清或已稀释好的尿液）分别50μl加入到相应的微孔中（双份检测）

4）在每一微孔中加入100μl酶联物（建议您使用多道移液器）。

5）室温环境下，在包被板摇床上（200rpm）温育1个小时。

6）每孔用300μl洗涤液洗板3次，并在吸水纸上拍干。

7）以相同的时间间隔，在每一微孔中加入150μl TMB底物液。

8）室温环境下，在包被板摇床上温育15-20分钟。

9）在每一微孔中加入50μl终止液。

10）加终止液后20分钟内450nm处读取OD值。

*如果OD值超过450nm滤光片的检测上限，我们可用405n或415nm代替，OD值可能会比较低，但它并不会影响样品和质控品的实验结果。

1）计算两个标准品OD值的平均值。

2）在半对数坐标纸上，以平均OD值为Y轴、标准品的浓度为X轴作一条校准曲线。如果使用免疫检测软件，我们可以作四参数曲线。

3）计算每一未知样品OD值的平均值。

4）直接从标准曲线上读取样品的浓度。

5）将获得的样品浓度值乘以稀释因子。然后乘以24小时尿液的体积，从而其闪单位可变为pg/24小时。zui后将pg/24小时除以10⁶，相应的单位就变成μg/24小时。

6）如果血清样品浓度高于2500pg/ml,我们可以用标准品A将其进行稀释（但稀释比例不高于1：8）。则其结果应乘以相应的稀释因子。

 

 

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

 

 

 

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