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基孔肯雅IgM抗体ELISA检测试剂盒主要用于定性检测人血清和血浆中抗基孔肯雅病毒的IgM抗体。

此试剂盒基于ELISA技术。包被板中包被了抗人IgM抗体，如果人血清或血浆中含有IgM时，则会与其特异性结合，洗板将未结合的物质洗去， 然后加入基孔肯雅抗原溶液，洗板洗去未结合的物质，然后加入链霉亲和素和基孔肯雅抗体酶联物。洗板后，加入TMB底物液，颜色变成蓝色，加入终止液终止反 应，颜色由蓝色转为黄色，zui后用酶标仪在450nm处读数。

包被板：12×8可拆卸，包被了抗人IgM抗体，密封在可重封铝箔袋中

基孔肯雅溶液1：1瓶包含6mL的基孔肯雅抗原溶液，即用，白盖

基孔肯雅溶液2：1瓶包含6mL的生物素化的基孔肯雅抗体，即用，蓝色，白盖

基孔肯雅IgM阳性质控：1瓶，1.5mL，黄色，即用，红盖

基孔肯雅IgM临界质控：1瓶， 2mL，黄色，即用，绿盖

基孔肯雅IgM阴性质控：1瓶，1.5mL，黄色，即用，蓝盖

样本稀释液： 1瓶包含100mL的即用缓冲液，用于稀释样本，pH7.2±0.2，黄色，白盖

洗涤液：1瓶，包含50mL  20倍浓缩的缓冲液，（pH7.2±0.2）用于洗板，白盖

链霉亲和素结合液：1瓶包含6mL过氧化物酶结合的链霉亲和素，即用，红色，黑盖

TMB底物液：1瓶包含15mL  TMB，即用，黄盖

终止液：1瓶包含15mL，即用，内含硫酸，0.2mol/l，红盖

 

             固定板

             封板片

             酶标仪（450/620nm）

             37℃孵箱

             洗瓶或自动洗板机

             10~1000μL的移液器

             漩涡混匀器

             蒸馏水或去离子水

             一次性试管

             计时器

试剂在有效期内，储存于2-8℃稳定

洗涤液的准备

用双蒸水稀释洗涤液，例子：10ml洗涤液+190ml双蒸水。稀释好的洗涤液在室温下5天内有效。

这个实验中使用的样本是人血清和血浆，如果实验在样本采集后的5天内进行，则需要储存在2-8℃，否则，必须于-20℃到-70℃深度冻存。如果样本是深度冻存的，在使用前，则需要充分混匀，避免反复冻融。

不推荐使用热灭活的样本

将10μL样本跟1ml的样本稀释液混匀，并用漩涡混匀器充分混匀。

在开始试验前，请仔细阅读试验说明。结果的可信度是依赖于严格地按照实验说明来进行的，铺板时zui少留1个孔为空白对照（A1）1个阴性质控孔（B1）2个临界质控孔（C1+D1）1个阳性质控孔（E1）。开始试验前，请将所有试剂都平衡到室温

1.         吸取50μL的质控品和稀释过的样本到相应的孔中，留A1孔做空白对照孔

2.         封板

3.         在37±1℃下孵育1小时±5分钟

4.         当孵育完成时，揭去封板片，弃去反应液，每孔300μL洗涤液，洗板3次，避免溢出。每孔浸泡的时间都必须＞5秒，zui后拍板将残留的液滴都拍去。

5.         吸取50μL基孔肯雅溶液1到除了空白对照孔的每个孔中，盖板

6.         在室温孵育30分钟

7.         重复步骤4

8.         将基孔肯雅溶液2跟链霉亲和素结合物混匀10分钟

9.         吸取50μL基孔肯雅溶液2跟链霉亲和素的复合物到除了空白对照孔的每个孔中，盖板。

10.     室温孵育30分钟

11.     重复步骤4

12.     吸取100μL  TMB底物液到每个孔中

13.     避光孵育15分钟（）

14.     加入100μL终止液到每个孔中，与加TMB底物液时的间隔和顺序都必须一样

15.     用酶标仪在加入终止液后30分钟内与450/620nm处检测

调整酶标仪，以空白对照孔调零，以450nm处检测所有孔的吸光度值。

只有以下条件符合，检测的结果才能认为的有效的

  空白对照孔             吸光度值＜0.100

  阴性质控孔             吸光度值＜临界质控

  临界质控孔             吸光度值0.150-1.300

  阳性质控孔             吸光度值＞临界质控

如果以上条件不符合的，那么试验结果则是无效的，需要重新检测

临界质控平均吸光度值的计算，例子：吸光度1：0.39；吸光度2：0.37

                                  （0.39+0.37）/2=0.38

                                 平均吸光度值为0.38

样本如果是比临界值高出10%，则认定为阳性，

样本如果是在临界值上下10%之内，则认定为灰色区（推荐在2-4周之后再次检测新鲜的样本，如果样本仍然是灰色区，可以直接认为是阴性）

样本如果是比临界值低出10%，则认定为阴性

病人样本平均吸光度值×10     = U

   临界值

 

 

例子： 1.216×10    =32U

0.38

临界值： 10   U

灰色区：9-11   U

阴性：   ＜9   U

阳性：   ＞11  U

 

 

 

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