CA72-4 ELISA试剂盒说明书
（德国DRG进口原装：EIA5071）
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1、简介
DRG CA72-4 ELISA试剂提供的材料用于在人体血清或血浆中定量检测肿瘤相关抗原CA72-4 （TAG-72）。本实验仅供体外诊断使用。
CA72-4（癌抗原72-4）zui初被描述为由B72.3识别的抗原因子。B72.3是由相应的原发肿瘤转移后的膜萃取物免疫杂交生产的鼠单克 隆抗体。CA72-4被证实是1MDa的粘液样糖蛋白，合成物称为TAG72（肿瘤相关抗原72）。TAG72蛋白的分子量为48KD. 血清和血浆中的CA72-4的水平升高见于某些恶性疾病，包括胰、胃、胆、结肠、乳腺、卵巢、子宫颈、子宫内膜的肿瘤。它对胃肠道和卵巢的肿瘤有很高的诊 断学的敏感性。尽管在一些良性的疾病如风湿病和卵巢囊肿也发现有CA72-4的升高，但是临床研究表明，对于胃肠道和卵巢肿瘤，特异性诊断高达95％。 CA72-4的水平和肿瘤的大小及分级紧密关联。CA72-4是胃肠道肿瘤的病人选择治疗学的监测和随后的护理的指标。另外合适的指标是CA199和 CEA，另外，CA72-4是卵巢肿瘤的病人选择治疗学的监测和随后的护理的可靠性指标，尤其是对于CA125阴性的病人。
2、实验原理
DRG公司的CA72-4酶免实验是一种基于夹心法原理的固相酶免吸附实验（ELISA）。反应板上的微检测孔包被有能结合CA72-4分子上*抗原位 点的单克隆小鼠抗体。一份含有内源性CA72-4的病人样本在包被孔中与酶联物进行孵育，该酶联物是一种联结有辣根过氧化物酶的抗CA72-4抗血清。孵 育后，用洗涤液洗去未结合的酶联物。结合上的辣根过氧化物酶的总量与样本中CA72-4的浓度成正相关。加入底物溶液后，显出的颜色强度与病人样品中 CA72-4的浓度成正比。
3、试剂盒成分
1）微孔板：12x8孔，可拆，微孔中包被抗CA72-4 单克隆抗体。
2）标准品（标准品0-4）：5支 0.5ml，即用，浓度为0,3，20，50，100U/ml，内含无水银防腐剂。
3）质控高&低：2支 冻干粉，0.5ml，见“试剂准备”，质控品的浓度及范围请见试剂瓶标签或质控单。内含无水银防腐剂。
4）样品稀释液：一支，3ml，即用，内含无水银防腐剂。
5）酶联物：1支 14ml，标记辣根过氧化物酶的抗CA72-4抗体，内含无水银防腐剂。
6）TMB底物液：一支 14ml，即用。
7）终止液：0.5M的硫酸，一支 14ml，即用，避免接触终止液，以免刺激或着烧皮肤。
8）洗涤液（40X）：一支 30ml.
注意：用于样品稀释的样品稀释液应视需要而定。
4、实验需要器材（但试剂盒不提供）
1） 酶标仪（450±10nm）。
2） 移液器
3） 吸水纸
4） 蒸馏水
5） 计时器
6） 坐标纸或是数据处理软件
5、试剂的储存与稳定性
未开启的试剂在2-8℃下储存，在保质期内保持其稳定性。不要使用过期的试剂。所有开启了的试剂都应在2-8℃下储存，微孔板需在2-8℃下储存，一旦打开了微孔板的袋子，需小心地将其重新密封。
6、试剂的准备：
在使用前将所有的试剂和所需的板条平衡至室温。
质控品：在冻干粉中加入0.5ml的蒸馏水使其复溶，并至少放置10min，在使用前充分摇匀。复溶后的质控品需在-20℃下储存。
洗涤液：在30ml浓缩的洗涤液中加入1170ml的蒸馏水，zui终洗涤液的容积为1200ml。稀释后的洗涤液在室温下两星期内保持稳定。
7、样品的采集与存储
本实验可使用血清或血浆（使用EDTA或肝素抗凝）样品，不要使用溶血﹑脂血﹑黄疸的样品。注意：含叠氮钠的样品不能用于此实验。
7.1样品采集
血清：静脉采血，允许使用凝血，在室温下用离心法分离血清。全血未*凝固前请勿离心，接受了抗凝剂治疗的病人血液可能需要更长的凝血时间。
血浆：将全血收集到含有抗凝剂的离心管内，收集后马上用离心法分离。
7.2样品的储存
样品盖好盖子后，可在实验前2-8℃下储存5天，要更长时间储存，应在-20℃下冻存。在开始实验前应避免反复冻融样品。
7.3样品的稀释
在zui初的实验中，要是样品的浓度高于zui高标准品，则样品应用按实验步骤所描述的10倍或100
倍稀释。在计算浓度时需乘以此稀释系数。
例子：
a） 按1：10稀释： 10ul的血清+90ul的样品稀释液（充分摇匀）。
b） 按1：100释稀：10ul按a）稀释的血清+90ul的样品释稀液（充分摇匀）
8、实验步骤
8.1总论
1）在使用前所有试剂和样品均需平衡至室温，所有试剂要充分混合但不要起泡。
2）一旦实验开始，所有步骤都必须进行到底而不能中断。
3）对每种试剂﹑标准品和样品使用一次性的吸嘴，以避免交叉污染。
4）吸光率决定于温育时间和温度，在开始实验前，建议准备好所有的试剂，将需要检测的微孔板固定在板架上，这些步骤保证每次加液步骤所需时间相同而没有中断。
5）按照一般的规律，酶反应时间与温育时间和温度成线性比例。
8.2操作步骤
每次实验都应含有一条标准曲线
1）将实验所需数目的板条固定在板架上。
2）用一次性吸嘴将20ul的标准品﹑质控品和样品加入相应的检测孔中。
3）每孔加入100ul的酶联物。
4）*混合十秒，在此步骤里，充分摇匀十分重要。
5）不用封板，在室温下温育120分钟。
6）快速弃去检测孔中的内含物，每孔用400ul洗涤液洗板五次，在吸水纸上用力拍板以除去残留的液体。注意：洗板步骤是否正确将直接影响到实验的灵敏度和性。
7）每孔加入100ul的底物液。
8）在室温下温育30分钟。
9）每孔加入100ul的终止液终止反应。
10） 在加终止液后十分钟内，室温下，于450nm处读取吸光率。
9、结果计算
1）计算标准品﹑质控品和病人样品的平均吸光率。
2）以吸光率为Y轴，浓度为X轴，按照从标准品中获得的平均吸光率和其相对应的浓度值，绘制标准曲线。
3）利用样品的平均吸光率，在标准曲线上得出其相应的浓度值。
4）自动方法：使用立方函数﹑四参数模式或双对数的计算机程序可得到结果。
5）样品的浓度可从标准曲线上直接获取。样品的浓度高于zui高标准品的浓度则需进一步稀释。在计算样品的浓度的时候，要乘以稀释倍数。
下面是CA72-4 ELISA的标准曲线的典型例子。
| 标准品 | 吸光率（450nm） |
| 零标准品（0 U/ml） | 0.08 |
| 标准品1（3U/ml） | 0.19 |
| 标准品2（20 U/ml） | 0.59 |
| 标准品3（50 U/ml） | 1.16 |
| 标准品4（100 U/ml） | 2.02 |
本译文仅供参考，详情请以原文为准！
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