褪黑激素ELISA Kit
（德国IBL：RE54021）
1、应用范围
此试剂盒可用于人血清和血浆中褪黑激素的体外定量检测。
2、前言说明
松果体因其在光周期现象中的重要作用，已经被人们认为是神经内分泌的传感器。松果体主要分泌的激素是：N-乙酰-5-甲氧色胺和褪黑激素，褪黑激素一般是由色氨酸合成而来的。血浆褪黑激素的浓度可在夜间达到zui高。褪黑激素*的波动变化可以反映出一些关于时间变化的信息，如夜晚的长短。褪黑激素的分泌会受到神经系统的调节。交感神经系统在调节褪黑激素分泌方面发挥有重要作用，它主要是通过释放去甲肾上腺素来调节的。据报道，褪黑激素分泌方式和水平的变化与人的一些生理状态一致，如：失眠、时差感、情绪低落、压力大、精神分裂症、丘脑下部性闭经、妊娠、神经想食欲缺乏、某些癌症、免疫系统紊乱和青春期性成熟的影响。大多数循环褪黑激素都可在肝内代谢成6-羟基褪黑激素，之后变成6-硫酸褪黑激素而随尿液排除。尿液中6-羟基褪黑激素硫酸盐的浓度与血液中褪黑激素的总水平有很好的相关性。
3、实验原理
此ELISA试剂盒利用的是竞争法的原理。生物素和非生物素标记的抗原竞争性结合包被板上有限的抗体结合位点。生物素抗原结合到抗体上的量与样品中抗原的量成反比。系统达到平衡后，洗板除去游离的生物素抗原，结合到抗体上的生物素抗原可以用抗生物素碱性磷酸酶标记物和对硝基苯磷酸底物检测出来。用已知的标准品数据做一条标准曲线，将未知样品的酶活性与标准曲线进行比较就可以定量出未知样品的量。
4、储存与稳定性
试剂盒必须在2-8℃的环境下运输和储存，避免太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂准备将在相关章节中阐述,如果将包被板密封并储存于2-8℃的环境下时,试剂在有效期内稳定。用甲醇洗提后的提取柱可用于其它样品的提取或储存于2-8℃的环境下。提取柱可重复使用4次。
5、样品的采集与储存
血清，血浆（EDTA，肝素）
| 按照静脉穿刺的常规注意事项采集样品，血液样品自采集到实验时都必须保证其化学完整性。不要使用明显溶血、黄疸和脂血样品。混浊的样品应当在实验开始前离心以除去所有的颗粒性物质。 | ||||
| 储存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | ≤-70℃ | 避免太阳直射，避免反复冻融。 |
| 稳定性 | 24小时 | 3个月 | 1年 | |
6、试剂盒成分
| 数量 | 标记 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，多克隆）。 |
| 3×2ml | BIOTIN LYO | 褪黑激素生物素，冻干，内含稳定剂。 |
| 3×2ml | ANTISERUM LYO | 褪黑激素硫酸盐抗血清， 冻干粉，内含抗血清（兔，多克隆）和稳定剂。 |
| 1×250ul | ENZCONJ CONC | 酶联物，80倍浓缩，内含碱性磷酸酶标记的抗生物素抗体（羊）、Tris缓冲液和稳定剂。 |
| 1×6×2ml | CAL A-F LYO | 标准品A-F，冻干粉，内含稳定剂，提取浓度请见试剂瓶标签或QC质控品。 |
| 1×2×2ml | CONTROL 1+2 LYO | 质控品1+2，冻干粉，内含稳定剂，浓度/可接受范围请见试剂瓶标签。 |
| 1×50ml | ASSAYBUF CONC | 检测缓冲液，10倍浓缩，内含磷酸缓冲液、吐温和稳定剂。 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片，密封于铝铂金属袋中，内含对硝基苯硫酸盐。 |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物缓冲液，即用，内含二乙醇氨和水。 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP终止液，即用，内含1M的NaOH和0.25M的EDTA。 |
| 2×10 | EXTRCOL | 提取柱，即用，C18 RP，1m3/100mg。另需提取柱可从IBL定够（编号：KEME761） |
| 3× | FOIL | 粘性金属板 |
7、实验所需器材但试剂盒不提供
1）移液器，体积：50; 500ul
2）试管（12×75mm）
3）轨道振荡器（400-600rpm）
4）旋涡混合器
5）带储器的8道移液器
6）洗涤瓶，自动或半自动洗板机
7）离心机（冷冻离心机更适宜）：200-500×g，也可选用多头抽真空装置（例如：Mallinekrodt-Baker 或Waters）。
8）甲醇（HPLC级）
9）蒸发离心机
10） 可在405nm处读数的酶标仪（参考波长600-650nm）
11） 蒸馏水或去离子水
12） 吸水纸、取样吸头和计时器
8、实验前的准备说明
| 注意 | 用于96人份检测色试剂盒成分可分成3次进行。下列所述体积为检测32人份时所需要的量。 |
8.1冻干或浓缩成分的准备
| 稀释/溶解 | 成分 |
| 稀释剂 | 比例 | 备注 | 储存 | 稳定性 |
| 15ml | 检测缓冲液 | 150ml | 双蒸水 | 1：10 |
| 2-8℃ | 4周 |
|
| 标准品和质控品 | 2.0ml | 双蒸水 |
| 静置15min，混合时避免气泡 | ≤-20℃ | 直至有效期 |
|
| 褪黑激素生物素 | 2.0ml | 蒸馏水 |
| 静置15min，混合时避免气泡 | 临时配置,只能使用一次 | |
|
| 褪黑激素抗血清 | 2.0ml | 蒸馏水 |
| 静置15min，混合时避免气泡 | ||
| 70ul | 酶联物 | 5.6ml | 已稀释的检测缓冲液 | 1:81 |
| ||
| 3 | PNPP底物片 | 8ml | PNPP底物缓冲液 |
|
| ||
| 10ml | 未稀释甲醇 | 100ml | 蒸馏水 | 10%（v/v） |
| ||
如果溶液的需要量比较大,应该将试管内的溶液混合.避免反复冻融。
8.2样品的稀释
如果怀疑样品中的褪黑激素浓度比zui高标准品的高，必须将样品在提取步骤前用检测缓冲液进行进一步的稀释。
8.3样品、标准品和质控品的提取（提取柱）
按照此步骤进行提取，提取量大约为90-100%。
为了避免柱子堵塞，提取样品前将样品过滤或离心一下。
| 注意 | 每份样品、标准品和质控品都必须提取，提取必须提前进行。干燥的提取物（甲醇蒸发后）可在2-8℃或-20℃下储存24个小时。 用甲醇洗提后，提取柱就可以用于下一份样品的提取或是存放到2-8℃的环境下。提取柱可以反复使用4次。如果是重复使用，在再次从A.1开始（柱的调制）。 |
A、标准版本：离心与蒸发离心步骤
1.柱的调制
| 1 | 将提取柱放到聚苯乙烯或玻璃试管中（12×75mm）。 |
| 2 | 在提取柱中加入2×1ml的甲醇（未稀释的），200g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
| 3 | 向提取柱中加入2×1ml的蒸馏水，200g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
| 4 | 为了避免柱子变干，请立即提取样品。 |
2.样品提取
| 5 | 将提取柱放到相应的标记聚苯乙烯或玻璃试管中（12×75mm）。 |
| 6 | 向提取柱中加入0.5ml标准品、质控品和样品，200g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
3、洗涤
| 7 | 向提取柱中加入2×1ml的10%甲醇（蒸馏水稀释），500g离心1min使溶剂通过提取柱，弃取洗出液。 |
4、提取物的洗脱
| 8 | 将提取柱放到新的标记聚苯乙烯或玻璃试管中（12×75mm） |
| 9 | 向提取柱中加入1ml未稀释的甲醇，200g离心1min使溶剂通过提取柱。 |
| 10 | 将提取柱从试管中移出，避免液滴还停留在柱子中。将柱子用于下一份样品的提取或存放于2-8℃的环境下。提取柱可重复使用四次。 |
5.提取物的蒸发和重新配置
| 11 | 用蒸发离心机将甲醇蒸发掉。 |
| 12 | 用0.15ml的蒸馏水重新稀释配置样品 |
| 13 | 旋涡混和1分钟，并立即检测样品。 |
B、选择性版本：用多头抽真空装置代替离心机
| 提取步骤仍然按照A1-5进行，柱子不变。 用真空和≤5ml/min的流速使溶剂通过柱子。 样品和提取物用≤2ml/min的流速。 用蒸发离心机或氮气蒸发干燥溶剂。 |
9、实验步骤
| 1 | 将提取好的标准品、质控品和样品分别50ul加入到相应的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul褪黑激素生物素。 |
| 3 | 在每一微孔内加入50ul褪黑激素抗血清。 |
| 4 | 盖板，轻轻震板，2-8℃下温育14-20小时。 |
| 5 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的检测缓冲液洗板3次，吸水纸上拍干以除出残余液体。 |
| 6 | 在每一微孔中加入150ul临时配置好的酶联物。 |
| 7 | 盖板，室温（18-25℃）轨道振荡器上（500rpm）温育120min。 |
| 8 | 大约在温育结束10分钟前准备好PNPP底物液。 |
| 9 | 移去粘性金属板，弃取孔内反应液，每孔用250ul稀释好的检测缓冲液洗板3次，吸水纸上拍干以除出残余液体。 |
| 10 | 如果有8道移液器，请用8道移液器加底物液和终止液，加底物液和终止液的时间间隔应当相同。使用主动置换型移液器并避免气泡产生。 |
| 11 | 在每一微孔中加入200ul临时配置好的PNPP底物液。 |
| 12 | 室温（18-25℃）轨道振荡器上（500rpm）温育20-40min。 |
| 13 | 在每一微孔中加入50ul PNPP终止液，轻轻震板以使溶液混合均匀。 |
| 14 | 加终止液后60min内在405nm处读取OD值。（参考波长：600-650nm） |
10、结果计算
在半对数坐标纸上或自动计算的方法，以标准品的OD值（Y轴，线性）对其浓度（X轴，对数）做一条标准曲线。使用三次回归、四参数或双对数曲线方程可以得到更好的标准曲线。在推算标准曲线时，应当充分利用好每一个标准品数值（明显逸出的数值应当被忽略，再使用更加合理的数值代替它）。样品的浓度可以从标准曲线上直接读取。从坐标纸上读取结果时应当把起始的稀释倍数考虑进去。将稀释了的样品结果乘以稀释因子即可得到其相应的结果。样品中抗体浓度高于zui高标准品的样品，应当按实验前准备说明所述的方法进行稀释，并重新检测。
转换系数：褪黑激素（pg/ml）×4.30=pmol/l
典型标准曲线
（例子：不能用来定量
| 标准品 | 褪黑激素（pg/ml） | 平均OD值 | OD/ODmax（%） |
| A | 0.0 | 1.517 | 100 |
| B | 3.0 | 1.383 | 91.1 |
| C | 10 | 1.214 | 80.1 |
| D | 30 | 0.867 | 57.1 |
| E | 100 | 0.434 | 28.6 |
| F | 300 | 0.260 | 17.1 |
11、期望值
实验结果不能当作确定治疗结果的*因素，疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。对明显健康的一组人群进行研究发现，人体内的褪黑激素水平有着明显的生理周期变化，褪黑激素白天的水平很低，而晚上的水平则很高，而且个体之间的差异也很大。此外，褪黑激素的水平也与年龄有关系，其zui高浓度是在婴儿（3岁）样品中发现的。对6个明显健康献血者的褪黑激素生理周期进行研究。褪黑激素大概在白天下午四点zui低，其平均值是4.6pg/ml；早晨4点达到，平均值为77.5pg/ml。健康个体之间的褪黑激素zui高值差异很大，建议每个实验室都确定自己实验室的正常值范围。
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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