孕酮（PRG）ELISA 试剂盒

（德国DRG：EIA-1561）

1、前言

   孕酮是一种类固醇激素，含21个碳原子，在C-3上连有酮基，在C-4与在C-5之间为双键连接。该类固醇激素是一种女性性激素，与雌激素共同在月经周期中调节附属的器官，它对于胚细胞着床前的子宫内膜增生状态和维持孕期是特别重要的。在非孕期妇女怀孕的胎盘成为主要来源。极少数来源于两性的肾上腺皮质。孕酮在循环血中主要与皮质类固醇结合蛋白（CBG），性激素结合蛋白（SHBG）和白蛋白结合，仅有循环总浓度的2-10%是游离激素。根据月经循环周期血孕酮浓度范围很宽，在卵泡期可以低于1ng/ml（3.2nmol/L），在黄体期达到10-20ng/ml（32-64nmol/L）。在排卵后4-7天达到zui高水平保持4-6天，在月经开始前24小时降至排卵前的水平，因为孕酮的升高和降低与卵巢卵泡和黄体的活动相对应，因此血浆孕酮的测定在临床上常用来证明排卵和非孕妇女的黄体功能正常。假如排卵没有发生，黄体则没有生成进而孕酮升高的循环也不能见到，异常的孕酮分泌与经前期紧张子宫内膜异位症痛经和黄体不全有关。孕酮浓度不仅个体之间有差异，而且同一个人每天甚至每个小时都会不同，一般的在妇科内分泌紊乱或异常妊娠为了恰当的解释病因连续测定比单个测定更有意义。在孕期孕酮更多的由胎盘产生，血浆水平在这个时期稳定在200ng/ml的水平。

2、实验原理

   DRG公司的孕酮酶免试剂盒是一种基于竞争法原理的固相酶免吸附实验（ELISA）。反应板上的微检测孔包被有能结合孕酮分子上*抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性孕酮的病人样本与辣根过氧酶标记的孕酮竞争性的结合包被板上的抗体。温育之后，未结合的酶联物用洗涤液洗去。过氧酶与包被抗体的结合量与样品中孕酮的浓度成反比。加入底物液后，所显示的颜色强度与病人样品中孕酮的浓度成反比。

3、试剂盒成分

1）       预包被反应板    ，12条X8孔，96孔，微孔中包被了单克隆的抗孕酮抗体。

2）       标准品系列，7支，1ml，浓度：0；0.3；1.25；2.5；5；15；40ng/ml，转换系数：1ng/ml=3.18nmol/ml，内含0.3%的Proclin防腐剂，

3）       酶联结物     ，1支，25ml，辣根过氧酶标记的孕酮，内含0.3%的Proclin防腐剂。

4）       底物液，1支，25ml，TMB

5）       终止液，1支，14ml，内含0.5M的H₂SO₄

6）       浓缩洗涤液（40X），1支，30ml.

注：用于样品稀释的零标准品应视需要而定。

4、实验需要器材（但试剂盒不提供）

1）       酶标仪（450±10nm）。

2）       移液器

3）       吸水纸

4）       蒸馏水

5、试剂贮存:

   未开启的试剂在2—8℃下贮存时，其活性在有效期内稳定，不要使用过期试剂。所有开封了的试剂都必须储存于2-8℃的环境下，微孔反应板也必须贮存于2—8℃的环境下。一旦包装袋被打开，必须将它小心地严封起来。

6、试剂准备

实验开始前，将所有的试剂和所需数目的板条都平衡至室温。

洗涤液：在30ml的浓缩洗涤液中加入1170ml去离子水进行稀释，稀释好的洗涤液室温下可稳定存放2周。

7、样本采集和准备

此实验中要使用到血清或血浆（EDTA-，肝素血浆），不要使用溶血、黄疸血或脂血样品。请注意：含叠氮钠的样品不能用于此实验中。

7.1样品的采集

血清：静脉穿刺采集全血，待其凝血，在室温下用离心机分离血清。未*凝血前请勿离心，接受了抗凝剂治疗的病人样品可能需要更长的凝血时间。

血浆：将全血收集到含抗凝剂的离心试管中，采集后立即离心。

7.2样品的储存

实验开始前，应当将样品用盖子盖好，2-8℃环境下可稳定存放24个小时。如果实验前想要将样品存放更长的时间，则应将样品冻存于-20℃的环境下。解冻的样品在实验前应反复倒置几次。

7.3样品的稀释

在实验时，如果血清样品中睾酮的浓度高于zui高标准品中睾酮的浓度，则应将此样品用零标准品稀释10或100倍，并按实验步骤重新检测。在计算浓度时应当将此稀释因子考虑进去。

例如：

a）  按1：10的比例稀释：10μl的血清+90μl零标准品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀释：10μl已稀释好的a）+90μl零标准品（充分混合）

8、实验步骤：

1）       将所需数量的板条固定到板架上。

2）       将标准品、质控品和已稀释好的样品分别用新的取样吸头取25μL加入到相应的微孔中。

3）       室温温育5分钟。

4）       在每一微孔中加入200μL酶联物。

5）       充分混匀10秒，在这个步骤*混匀很重要。

6）       室温孵育60分种。

7）       快速弃去孔内反应物，每孔用400μL蒸馏水洗板3次，在吸水纸上拍干。注意：洗板步骤是否正确操作会明显影响实验的灵敏度和度。

8）       在每一微孔中加入200μl底物液。

9）       室温孵育15分种。

10）   加100μl终止液到每个检测孔中终止酶反应。

11）   加终止液后10分钟之内，用酶标仪在450±10nm处测定OD 值。

9、结果计算

1）       计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。

2）       用吸光度值作为纵坐标（y），浓度值作为横坐标（x），以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值进行标绘，作一标准曲线。

3）       用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。

4）       自动计算方法：在IFU上，它用四参数曲线已自动计算出结果。其它的归纳方法可能会得出稍微不同的结果。

5）       样品的浓度可直接从标准曲线上读取。样品中孕酮浓度高于zui高标准品的必须用进行进一步的稀释。在计算样品浓度时就应当把此稀释因子考虑进去。

10、参考值

我们强烈建议各个实验市都建立自己的正常值和异常值。在一明显正常人群的研究中，我们使用DRG公司的孕酮ELISA试剂盒进行检测得到如下结果：

           正常女性：

                 卵泡期         0.2 - 1.4ng/ml

                 黄体期          4 – 25ng/ml

                 绝经期         0.1 – 1ng/ml

           正常男性：         0.1 – 1ng/ml

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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