黄体生成素（LH）ELISA试剂盒

 （德国DRG：EIA-1289）

1、 应用范围

DRG公司的LH酶联免疫吸附试剂盒可用于血清中黄体生成素（LH）的定量检测。此检测试剂盒仅供体外诊断用。

2、前言说明

在受到下丘脑释放的黄体生成素释放激素（LH-RH或者Gn-RH）的影响下，男性和女性的垂体前叶都可以产生LH（黄体生成素）。在男性中，LH也叫做促间质细胞激素（ICSH），它是一种分子量大约为30000道尔顿的糖蛋白。它是由两条不同的氨基酸链通过非共价键结合形成的复合物，一条α链，一条β链。α链与在人促甲状腺激素（TSH）、卵泡刺激素（FSH）和人绒毛膜促性腺激素中找到的α链糖蛋白类似。这些激素的不同主要是由于他们β链的氨基酸组成不同所造成的，这也使它们产生了不同的免疫学功能。男性中LH的分泌是间歇性的，它的基本功能是刺激间质细胞（莱迪希细胞）分泌睾酮。妇女体内LH浓度的变化会受到正常月经复杂排卵循环的影响，这也依赖于沿性腺-下丘脑-垂体轴的一系列激素活动。排卵前孕酮和雌二醇水平的降低启动了每一个月经周期。随着激素水平的降低，下丘脑就增加促性腺激素释放激素（GnRF）的分泌，它可依次刺激垂体增加FSH的生产和分泌。增加的FSH水平在卵泡阶段可刺激一些卵泡的成熟，其中的一个卵泡就会成熟为含卵子的卵泡。随着卵泡的发育，雌二醇就开始分泌，刚开始时很慢，但经过12或13天的正常循环后它就开始迅速增加。因为垂体的直接刺激和增加的GnRF和FSH水平，雌二醇的就开始迅速增加，随之LH就开始释放了。而这些事件正好组成了排卵前期。在LH达到zui高水平后，排卵作用大约会持续12到18个小时。排卵后就会形成可分泌孕酮和雌激素（这两种激素是LH的两个反馈调节物）的黄体。黄体期迅速的紧随排卵期而来，黄体期明显表现为高孕酮水平，雌二醇第二增加，低LH和FSH水平。低LH和FSH水平是沿下丘脑-垂体轴雌二醇和孕酮负反馈反应的结果。受孕后，胚胎的发育可产生hCG，hCG使得黄体继续产生孕酮和雌二醇。如果没有受孕，黄体就会退化，相应的孕酮和雌二醇水平就会降低，从而导致了月经的形成。随着这些激素低激素水平的形成，下丘脑就又再次开始一月经周期患性腺机能退减的病人，其血清LH的浓度会增加。由于卵巢的发育不成熟、原发性的卵巢功能衰竭、多囊卵巢疾病或绝经等原因，女性体内类固醇激素的分泌会减少，而且在这些情况下，LH的分泌没有受到调节。在男性中，但睾丸发育不正常或存在无睾畸形时，也同样会失去调节激素。在原发性睾丸衰竭和克氏综合征患者中，尽管在雄性激素持续分泌的情况下LH浓度没有必要提高，但我们也可发现其体内存在着高浓度的LH。在肾衰竭、肝硬化、甲状腺功能亢进和严重饥饿的情况下，LH的浓度也可出现提高。垂体前叶激素的分泌不足也可能导致低LH水平。正如人们所预测的，低LH水平可能导致男性和女性不育。虽然LH的低水平在垂体前叶对GnTH刺激反应失效的情况下也会出现，但由于下丘脑GnRH分泌的降低，LH的水平就有可能降低。因此低LH水平可表明垂体或下丘脑存在功能障碍，但具体的问题根源必须通过其它实验确定。在下丘脑、垂体或性腺功能障碍的鉴别诊断中，LH浓度的检测常与FSH一起进行检测（以为两者的功能紧密相连）。此外，激素的水平也可用来确定是否绝经、计算排卵时间和监测内分泌治疗效果。

3、实验原理

   DRG公司的LH酶免实验是一种基于夹心法原理的固相酶免吸附实验（ELISA）。反应板上的微检测孔包被有能结合LH分子上*抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性LH的病人样本在包被孔中与酶联物进行孵育，该酶联物是一种联结有辣根过氧化物酶的抗LH抗血清。孵育后，用洗涤液洗去未结合的酶联物。辣根过氧化物酶符合物的总量与样本中LH的浓度成正相关。加入底物溶液后，显出的颜色强度与病人样品中LH的浓度成正比。

4、试剂盒组成:

1）      微量反应板，1块 （ 96孔），包被了抗LH的单克隆抗体。

2）      标准系列:6支，冻干，1ml，浓度: 0,10,20,40,100,200mIU/ml

3）      酶联物，1支，11ml，辣根过氧酶标记的抗LH抗血清，0.3%的Proclin作为防腐剂。 

4）      底物液，14ml （TMB）

5）      终止液:1支，0.5M H₂SO₄, 14ml，避免接触终止液，以免刺激或着烧皮肤。

用于样品稀释的零标准品应视需要而定。

5、实验所需器材（但试剂盒不提供）

1）酶标仪

2）移液器，25；50；100μl.

3）蒸馏水

4）吸水纸

5）计时器

6）半对数纸

6、储存条件

   未开启的试剂在2—8℃下贮存，在有效期内可以保持活性。不要使用过期试剂，酶联物、底物溶液、标准品和零标准品必须在2—8℃下贮存。

   微孔反应板必须在2—8℃下贮存。一旦包装袋被打开，必须将它小心地严封起来。如果包被板的包装被打开，其免疫活性在6周内稳定，但前提是必须将它密封在装有干燥剂的袋子里。

7、试剂准备

实验开始前，将所有试剂和所需数目的板条都平衡至室温。

标准品：在每支冻干粉的标准品中加入1.0ml蒸馏水重新配置标准品。注意：配制好的标准品在2-8℃的环境下可稳定存放2个月，要想存放更长的时间则应冻存于-20℃的环境下。

8、样品

此实验将用到血清，请不要使用易溶血、黄疸血和脂血样品，注意：含叠氮钠的样品不可用于此实验。

8.1样品的采集

血清：静脉穿刺采集全血，待其凝固，室温离心分离血清。未*凝血前请勿离心，接受了抗凝剂治疗的病人可能需要更长的凝血时间。

8.2样品储存

实验开始前应用盖子将样品密封好，2-8℃下可存放48小时。如果将样品冻存于-20℃的环境下则可将其存放更长时间（只可冻融1次）。解冻的样本在实验之前必须要上下倒置几次。

8.3样品的稀释：

在*次实验中，样本浓度高于zui高标准品的样品应当在实验前用零缓冲液进行稀释。在计算浓度时，应当把此稀释因子考虑进去。例子：

a）按1：10稀释： 10μL的血清+90μL的零缓冲液（充分混合）。

b）按1：100稀释：10ul稀释好的a）+90μL的零缓冲液（充分混合）。

9、实验步骤

所有的标准品、样品和质控品都必须做双份检测以保证它们的检测条件都一样。每次检测都必须有一条标准曲线。

1）      将所需数目的板条置于板架上。

2）      将标准品、质控和血清样本分别25μl加入到相应的微孔中，每次都得使用新的取样吸头。

3）      加100μl的抗LH酶联物于各孔中。

4）      混匀10秒,此步骤中*混匀很重要。

5）      室温温育（22℃）30分钟。

6）      弃去孔内的反应液。用蒸馏水洗板5次（每孔400ul），在吸水纸上把板拍干以除去残余液体。注意：洗板步骤是否正确会明显影响实验的灵敏度和精密度。

7）      依原先加样顺序,每孔加100μl底物液。

8）      室温（22℃）温育10分钟。

9）      按加底物液顺序,每孔加50μl终止液于各孔中。

10）  加终止液后10分钟内在450nm波长读吸光度。

10、结果计算

1）      计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。

2）      用吸光度值作为纵坐标（y），浓度值作为横坐标（x），以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值（mIU/ml）进行标绘，作一条标准曲线。

3）      用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。

4）      自动计算方法：说明书上的结果是用四参数计算得到的，其它的归纳方法可能会给出稍微不同的结果。

5）      样品的浓度可直接从标准曲线上读取。样品中LH浓度高于zui高标准品的必须进行进一步的稀释，任何稀释了的样品在计算时都必须将相应的稀释因子考虑进去。

11、正常值

强烈建议每个实验室都确定自己的正常值范围和不正常值范围。

用DRG公司的LH ELISA试剂盒对明显健康人群进行一研究，得到如下结果：

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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