DRG瘦素ELISA试剂盒

（德国DRG: EIA-2395）

1、说明

DRG公司的瘦素酶免试剂盒可用于人血清和血浆中瘦素的定量检测。此检测试剂盒仅供体外诊断用。

2、实验原理

   DRG公司的瘦素酶免实验是一种基于夹心法原理的固相酶免吸附实验（ELISA）。反应板上的微检测孔包被有能结合瘦素分子上*抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性瘦素的病人样本在包被孔中与特异性兔抗瘦素抗体进行孵育，之后就会形成一个夹心复合物。孵育后，用洗涤液洗去未结合的物质，再加入过氧化物酶标记的抗兔抗体以检测结合在包被板上的瘦素的量。加入底物溶液后，显出的颜色强度与病人样品中瘦素的浓度成正比。

3、试剂盒成分

1）       包被板，12×8孔，可拆，微孔中包被了抗瘦素抗体（单克隆）

2）       标准品（0-5），6支 冻干型0.5mL，浓度：0,2,5,25,50,100ng/ml，内含0.3%的Proclin防腐剂

3）       质控品， 2支，200ul，即用，2个浓度（低与高），具体数值与范围请见试剂瓶标签或QC质控单。内含0.3%的Proclin防腐剂。

4）       实验缓冲液，1支，11ml，即用，内含0.3%的Proclin防腐剂

5）       抗血清，1支，11ml，即用，单克隆瘦素抗血清，内含0.3%的Proclin防腐剂。

6）       酶复合物，1支，11ml ，即用，辣根过氧酶标记的抗兔复合物，内含0.3%的Proclin防腐剂

7）       TMB底物液，1支，14ml，即用

8）       终止液，1支，14ml，即用，内含0.5M的H₂SO₄，避免接触终止液，以免刺激皮肤或灼烧皮肤。

9）       洗涤液（40×），1支 30ml

注：零标准品应视需要而定。

4、实验所需器材（但试剂盒不提供）

1）       酶标仪 （450±10nm）（如DRG 公司的酶标仪）

2）       取样枪

3）       吸水纸。

4）       蒸馏水

5、贮存条件  

   未开启的试剂在2—8℃下贮存，在有效期内可以保持活性。不要使用过期试剂。酶联物、底物溶液、标准品和零标准品必须在2—8℃下贮存。

   微孔反应板必须在2—8℃下贮存。一旦包装袋被打开，必须将它小心地严封起来。

6、样品采集

1）  血清：静脉穿刺采集全血，待其凝血，在室温下离心分离血清。未*凝血前请勿离心，接受了抗凝剂治疗的病人样品可能需要更长的凝血时间。

2）  血浆：将全血采集到含有抗凝剂的离心管，采集后立即离心分离。

3）  样品的储存：实验开始前应用盖子将样品密封好，2-8℃下可存放24个小时，如实验之前需将样品贮存更长的时间，应当将样品冻存于-20℃的环境下，并且只能冻存一次，不能反复冻存。解冻的样本在实验之前必须要上下倒置几次。

7、样品的稀释：

在*次实验中，要是样品的浓度高于zui高标准品，则样品应用按实验步骤所描述用零标准品进行稀释，并重新检测。并且在计算浓度时需乘上此稀释因子。

例子：

a）  按1：10稀释： 10μL的血清+90μL的零标准品（充分摇匀）。

b）  按1：100释稀：10μL按a）稀释的血清+90μL的零标准品（充分摇匀）

8、实验步骤

所有的标准品、质控品和样品都必须做双份检测以确保所有的检测条件都一样。每一次实验都有一条标准曲线。

1）将所需数目的板条置于板架上。。

2）用一次性吸嘴将标准品﹑质控品和样品分别15μL加入相应的检测孔中。

3）每孔加入100μL的检测缓冲液。

4）充分混合10秒，在此步骤中充分混合非常重要。

5）室温下温育120分钟。

6）快速弃去检测孔中的内含物，每孔用300μL洗涤液洗板三次，在吸水纸上拍干以除去残余液体。注意：洗板步骤是否正确操作会明显影响实验的灵敏度和度。

7）每孔加入100μL抗血清。

8）在室温下温育30分钟。

9）快速弃去检测孔中的内含物，每孔用300μL的洗涤液洗板三次，在吸水纸上拍干以除去残余液体。

10）每孔加入100μL酶联物。

11）在室温下温育30分钟。

12）快速弃去检测孔中的内含物，每孔用300μL的洗涤液洗板三次，在吸水纸上拍干以除去残余液体。

13）每孔加入100μL底物液。

14）室温温育15分钟。

15）每孔加入50μL终止液以终止酶反应。

16）在加终止液后10分钟内于450±10nm处读取OD值。

9、结果计算

1）       计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。

2）       用吸光度值作为纵坐标（y），浓度值作为横坐标（x），以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值进行标绘，作一标准曲线。

3）       用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。

4）       自动计算方法：在IFU上，它用四参数曲线已自动计算出结果。其它的归纳方法可能会得出稍微不同的结果。

5）       样品的浓度可直接从标准曲线上读取。样品中HPL浓度高于zui高标准品的必须用进行进一步的稀释。在计算样品浓度时就应当把此稀释因子考虑进去。

10、参考值

我们强烈建议各个实验市都建立自己的正常值和异常值。以下结果是以一定量正常人群的血液样本为准得出的实验结果：

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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