C-肽ELISA试剂盒

 （德国DRG*：EIA-1293）

1、DRG公司C-肽ELISA试剂盒的临床应用

1）  接受了胰岛素治疗的糖尿病患者剩余β-细胞的功能评价。

2）  I型糖尿病患者缓解阶段的检测与监控。

3）  作为I型糖尿病（胰岛素依赖性）和II型糖尿病（非胰岛素依赖性）鉴别诊断的辅助工具。

4）  胰岛素引起的假低血糖症的诊断。

5）  辅助胰岛素瘤的诊断。（胰岛素抑制实验）

6）  用于检测糖尿病孕妇妊娠成功的预后指数。

7）  肝病患者胰岛素分泌的评价。

8）  胰腺切除术的监测。

2、实验原理

DRG公司C-肽ELISA试剂盒是以竞争原理为基础。样品中存在的未知含量的C-肽和已知浓度的C-肽酶联结物相互竞争结合到小鼠抗C-肽抗血清的结合位点。再与包被在检测孔上的抗小鼠抗体结合。没有结合的酶复合物被冲洗下来。加入底物溶液后，样本中的 C-肽浓度和测得的光密度成反比例。

3、试剂盒组成

1）       微孔反应板，96（孔），包被孔中包被了抗小鼠抗体。

2）       酶联结物，14ml。即用型，内含C-肽生物素标记物和稳定缓冲液。

3）       酶复合物，14ml，即用型，内含辣根过氧化物酶

4）       标准品系列（0-5），0-16ng/ml（具体浓度请见试剂瓶标签）。冻干粉，6支，用前加蒸馏水0.75mL。

5）       样品稀释液，3ml，即用型。

6）       抗血清：小鼠抗C-肽单克隆抗体，1支，7mL。

7）       底物液，TMB，14ml

8）       终止液，0.5M的H₂SO₄，14ml。

9）       浓缩冼涤液，40倍浓缩，30ml。

4、实验所需器材但试剂盒不提供

1）  酶标仪

2）  移液器，100；200和1000μl

3）  标准冰箱

4）  吸水纸

5）  去离子水

5、贮存条件

当贮存在2?8℃下，未打开的试剂在有效期内均有效。不要使用过期试剂。半标准品配制好后，所有剩余的标准品必须冷藏于2?8℃的环境下。要更长时间的贮存，可将重新配制好的标准品冻存于-20℃的环境下。C- 肽生物素联结物、酶复合物、底物溶液、洗涤液和零标准品必须冷藏于2?8℃的环境下。微孔反应板也必须冷藏于2?8℃的环境下。一旦包装袋拆开，必须将它重新密封好。

6、样本的采集和准备

血清：静脉穿刺采集全血，待其凝血，在室温下离心分离血清。未*凝血前请勿离心，接受了抗凝剂治疗的病人样品可能需要更长的凝血时间。样本在2~8℃下能存储24小时，如果需要储存更长时间则需要在﹣20℃下冻存，并且只能冻融一次

血浆：将全血采集到含有抗凝剂的离心管，采集后立即离心分离。样本在2~8℃下能存储24小时，如果需要储存更长时间则需要在﹣20℃下冻存，并且只能冻融一次

尿液：

1）       24小时内排泄出的尿液总量应收集和混合在单独的容器中。

2）       记录下尿液的总体积。

3）       充分混合样品。离心样本至澄清，在2~8℃下能储存36小时；如果要保存更长时间则需要在﹣20℃下冻存，只能冻融一次。

4）       实验样本用样品稀释液按1：20进行稀释。

7、试剂准备

标准品：用0.75ml蒸馏水溶解冻干标准品。可以保持不动直至*融化，然后通过轻轻的倒转充分混匀。重新标配的标准品在2~8℃能保存3天，如果需要保存更长时间则需要放置在﹣20℃下冻存

洗涤液：将30ml的浓缩洗涤液用去离子水1170ml稀释至1200ml。稀释后的洗涤液可在室温下稳定存放2周。

8、实验步骤

1）       将所需数目的板条置于板架上。

2）       将100μl C—肽标准品，和样本加到相应的检测孔中。

3）       各孔中加入50μl抗血清。

4）       各孔中加入100μl酶联结物。

5）       充分振荡混匀10秒钟。

6）       室温温育60min。

7）       弃去孔内反应液。

8）       用洗涤液洗板3次（每孔400μl）。末次在吸水纸上拍干反应板。

9）       在每微孔中加入100μl酶复合物。

10）   室温温育30分钟。

11）   弃去孔中的反应液。用洗涤液洗板3次（每孔400μl）。末次在吸水纸拍干反应板。

12）   以相同的时间间隔在每一微孔中加入100μl底物液。

13）   室温静置20分钟。

14）   以相同的时间间隔在每一微孔中加入100μl终止液以终止酶反应。

15）   在加完终止液后10分钟内在450±10nm处测OD值。

9、结果计算

可以使用任何一个能在450±10nm处测定吸光度值的酶标仪。按下述方法可求得每个样本血清的C—肽含量值。

1）       在线性或半对数坐标纸上，以每个参考标准品的平均吸光度值（Y）对它们相应的浓度值（X，ng/ml）做一标准曲线。我们建议您用四参数作标准曲线。

2）       利用每个血清样本的平均吸光度值，通过从标准曲线上读取相应的C-肽值，如有必要，还乘上初始样本的稀释倍数，便可得知它们相应的浓度值。利用DRG公司的ELIZAMAT3000和回归程序可以读出数值，并通过使用四参数逻辑功能或立体回归得到计算机辅助的解释。

期望值：

血清、尿液中C—肽的正常范围。

    建议每个实验室建立起自己的正常人C—肽水平范围。用DRG公司的C—肽酶联试剂盒检测正常男性和女性所得到的正常范围值罗列如下：

     此外，用6个空腹12个小时后的正常成人做葡萄糖测定。在空腹12小时后，抽取血清。接受测定的人跟着服用50-60克的葡萄糖，在30-45分钟后再抽取血清样本进行检测，结果发现C-肽水平增加了200-600%。

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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