按照给定的顺序执行所有测定步骤，并且在步骤之间没有任何明显的延迟。应使用干净的一次性吸头来分配每个质控和样品。将培养箱调整至37°C±1°C。
1.将100μl质控品和稀释样品加入到各孔中。保留A1为基底空白。
2.使用试剂盒中提供的盖板膜盖板。
3.在37±1℃下孵育1小时±5分钟。
4.孵育完成后，移去铝箔盖板膜，弃去孔中的内容物，用300μl洗涤液洗涤各孔三次。避免溶液溢出反应孔。每个洗涤周期之间的浸泡时间应为>5秒。最后，在下一步之前，在吸水纸上拍干板孔中液体。
注意：洗涤至关重要！洗涤不足导致精度差和吸光度值错误升高。
5.将100μl酶结合物加入到除空白孔（例如A1）外的所有孔中。盖板。
6.室温（20〜25℃）孵育30分钟。避免暴露在阳光下。
7.重复步骤4。
8.每孔加入100μlTMB底物溶液。
9.在黑暗中室温（20〜25℃）孵育15分钟。
10.以与TMB底物溶液相同的顺序和相同的速率将100μl终止液加入到所有孔中。
