睾酮ELISA试剂盒（德国DRG：EIA-1559）
1、前言
DRG公司的睾酮酶免试剂盒可用于人血清和血浆中睾酮的定量检测。此试剂盒仅供体外诊断用。
睾酮（17β-羟基-4-雄烯-3-烷）是一种19C的类固醇激素，它在C-4和C-5间含一个不饱和键，C-3位置有一个酮基，C-17的β位上有一个羟基。此类固醇激素的分子量为288.47。睾酮是分泌到血液中zui主要的雄性激素。在男性中，睾酮主要由睾丸的间质细胞分泌；在女性中，处于循环中的睾酮50%来源于外周雄烯二酮的转换，25%来源于卵巢，25%来源于肾上腺。睾酮负责男性第二性征的形成，检测睾酮浓度有助于评价性腺机能减退的状态。在女性中，在很多疾病中睾酮的浓度都很高，如：多毛症，女子男性化，多囊卵巢症，卵巢癌，肾上腺癌和肾上腺增生。而在男性中，高水平的睾酮通常与下丘脑垂体疾病、睾丸癌、先天性肾上腺增生和前列腺癌有关。在患下列疾病的病人体内，通常可发现睾酮水平很低：垂体机能减退症、克氏综合征、睾丸女性化综合征、睾丸切除术、隐睾病、酶缺陷和一些自身免疫疾病。
2、实验原理
DRG公司的睾酮酶免试剂盒是一种基于竞争法原理的固相酶免吸附实验（ELISA）。反应板上的微检测孔包被有能结合睾酮分子上*抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性睾酮的病人样本与辣根过氧酶标记的睾酮竞争性的结合包被板上的抗体。温育之后，未结合的酶联物用洗涤液洗去。过氧酶与包被抗体的结合量与样品中睾酮的浓度成反比。加入底物液后，所显示的颜色强度与病人样品中睾酮的浓度成反比。
3、试剂盒成份
1） 预包被反应板，12×8孔，包被板上包被了单克隆的鼠抗睾酮抗体。
2） 标准品系列，共7支，1.0 ml/支，浓度：0；0.2；0.5；1；2；6；16ng/ml。
转换系数：1ng/ml=3.467nmol/l。
3） 酶联结物，1支，25ml，内含辣根过氧酶标记的睾酮。
4） 底物/显色剂，1支，25ml，内含TMB。
5） 终止液，1支，0.5M的H2SO4 ，14ml，避免接触终止液，以免刺激或着烧皮肤。
6） 浓缩洗涤液（40X），1支，30ml。
注意：用于样品稀释的零标准品因视需要而定。
4、实验所需材料（但试剂盒不提供）
1）标准移液器 2）酶标仪
3）吸水纸 4）蒸馏水
5、试剂盒的储存与稳定性
未开启的试剂在2—8℃下贮存时，其活性在有效期内稳定，不要使用过期试剂。所有开封了的试剂都必须储存于2-8℃的环境下，微孔反应板也必须贮存于2—8℃的环境下。一旦包装袋被打开，必须将它小心地严封起来。
6、试剂准备
洗涤液的准备
吸取40×浓度的洗涤液30mL用1170mL的蒸馏水混合定容至1200mL，稀释好的洗涤液在室温能保存2周
7、样品
在此实验中将用到血清或血浆（EDTA-，肝素-或柠檬酸血浆），不要使用溶血、黄疸血或脂血样品。
请注意：含有*的样本不能使用
7.1样品的采集
血清：静脉穿刺采集全血，待其凝血，室温下离心获取血清。
血浆：将全血收集到含抗凝剂的离心试管中，采集后立即离心。
7.2样品的储存
实验开始前，应当将样品用盖子盖好，2-8℃环境下可稳定存放5天。如果实验前想要将样品存放更长的时间，则应将样品冻存于-20℃的环境下。解冻的样品在实验前应反复倒置几次。
7.3样品的稀释
在实验时，如果血清样品中睾酮的浓度高于zui高标准品中睾酮的浓度，则应将此样品用零标准品稀释10或100倍，并按实验步骤重新检测。在计算浓度时应当将此稀释因子考虑进去。
例如：
a） 按1：10的比例稀释：10μl的血清+90μl零标准品（充分混合）
b） 按1：100的比例稀释：10μl已稀释好的a）+90μl零标准品（充分混合）
8、一般注意事项
1） 所有试剂和样本在使用之前必须平衡至室温。所有试剂必须摇匀但不能起泡沫。
2） 一旦检测开始，所有的操作步骤必须进行到底不能中断。
3） 为了避免交叉放映，每一标准品、质控品和样品的取样都必须使用新的取样吸头。
4） 吸光度值是由孵育的时间和温度所决定的。在实验开始之前，建议准备好所有的药剂旋开盖子。
5） 将所需检测的微孔板条固定在板架上等。这些准备工作将确保每次的加液步骤所需时间相同，没有中断。按一般的规律，酶免反应的强度与时间和温度成线性比例。
9、实验步骤：
1） 将所需数量的板条固定到板架上。
2） 将标准品、质控品和已稀释好的样品分别用新的取样吸头取25μL加入到相应的微孔中。
3） 在每一微孔中加入200μL酶联物。
4） 充分混匀10秒，在这个步骤*混匀很重要。
5） 室温孵育60分种。
6） 快速弃取孔内反应物，每孔用400μL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。注意：洗板步骤是否正确操作会明显影响实验的灵敏度和度。
7） 在每一微孔中加入200μl底物液。
8） 室温孵育15分种。
9） 加100μl终止液到每个检测孔中终止酶反应。
10） 加终止液后10分钟之内，用酶标仪在450±10nm处测定OD 值。
10、结果计算
1） 计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。
2） 用吸光度值作为纵坐标（y），浓度值作为横坐标（x），以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值进行标绘，作一条标准曲线。
3） 用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。
4） 自动计算方法：在IFU上，它用四参数曲线已自动计算出结果。其它的归纳方法可能会得出稍微不同的结果。
5） 样品的浓度可直接从标准曲线上读取。样品中HPL浓度高于zui高标准品的必须用进行进一步的稀释。在计算样品浓度时就应当把此稀释因子考虑进去。
11、参考值
我们强烈建议各个实验市都建立自己的正常值和异常值。在一次明显正常人群的研究中，我们使用DRG公司的睾酮ELISA试剂盒进行检测得到如下结果：
| 人群 | 5% | 95% |
| 男性 | 2.0ng/ml | 6.9ng/ml |
| 女性 | 0.26ng/ml | 1.22ng/ml |
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
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